항체의 메커니즘

Oct 15, 2023

Nature Communications 14권, 기사 번호: 1705(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

세균성 병원체는 면역조절 효소의 생성을 포함하여 인간의 면역체계를 회피하기 위해 복잡한 메커니즘을 진화시켰습니다. Streptococcus pyogenes 혈청형은 IgG Fc의 Asn297에 보존된 N-글리칸을 특이적으로 탈글리코실화하는 2개의 다중 모듈형 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제인 EndoS 및 EndoS2를 분비하여 항체 매개 효과기 기능을 비활성화합니다. 수천 개의 알려진 탄수화물 활성 효소 중에서 EndoS와 EndoS2는 글리칸 성분뿐만 아니라 당단백질 기질의 단백질 부분에 특이적인 소수의 효소를 나타냅니다. 여기에서는 IgG1 Fc 단편과 복합체를 이루는 EndoS의 저온EM 구조를 제시합니다. 소각 X선 산란, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발, 가수분해 활성 측정, 효소 동역학, 핵자기공명 및 분자 역학 분석과 결합하여 EndoS 및 EndoS2에 의한 IgG 항체의 인식 및 특정 탈당화 메커니즘을 확립합니다. 우리의 결과는 임상 및 생명공학 응용을 위해 항체 및 글리칸 선택성을 갖춘 새로운 효소를 설계할 수 있는 합리적인 기반을 제공합니다.

화농성 연쇄상구균(그룹 A 연쇄상 구균, GAS)은 경미한 피부 및 상부 호흡기 감염 외에도 생명을 위협하는 상태 및 감염 후 면역 관련 질환을 유발하는 그람 양성 병원성 박테리아입니다1. GAS는 면역체계를 회피하고 숙주의 집락화를 촉진하기 위해 다양한 메커니즘을 사용하는데, 특히 면역글로불린 G(IgG) 항체와 같은 면역체계의 주요 분자를 선택적으로 비활성화하는 효소의 분비가 가장 두드러집니다. 1a)2. EndoS3 및 EndoS24는 IgG 항체의 단편 결정성(Fc) 영역에 있는 Asn297 연결 N-글리칸을 가수분해하는 다양한 GAS 혈청형에 의해 생성된 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(ENGase)입니다. EndoS는 M1을 포함한 여러 GAS 혈청형에 의해 분비되는 반면, EndoS2는 M49 GAS 혈청형4에 의해서만 분비됩니다. 이러한 ENGase는 글리칸 성분뿐만 아니라 당단백질 기질의 단백질 성분에 특이적인 희귀한 유형의 탄수화물 활성 효소 중 가장 눈에 띄는 구성원입니다. 이 종류의 효소에 의한 단백질 특이성 메커니즘은 아직 설명되지 않았습니다. Asn297에 연결된 N-글리칸은 Fc γ 수용체(FcγR) 및 보체 C1q에 결합하는 IgG에 필요하며, 이는 항체 매개 효과기 기능을 유발합니다5,6,7,8. 따라서 이들 효소의 활성은 IgG 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 효과기 기능을 폐지하여 박테리아의 생존과 병독성을 증가시킵니다9. 따라서, IgG 특이적 ENGase는 다양한 동물 모델에서 자가면역 질환을 개선하는 것으로 나타났습니다10,11,12,13. 또한 EndoS와 EndoS2는 균질한 글리코폼14,15,16,17 및 약물 접합체18,19를 사용하여 항체의 화학효소적 합성을 위한 강력한 도구입니다. 혈청 내 IgG 항체의 Fc 영역 N-글리칸은 33개 이상의 별개의 당형으로 구성되며20 그들의 독특한 화학 구조는 FcγR에 대한 Fc 결합을 변경하여 이펙터 기능을 조절하고 항체의 안정성과 반감기를 조절합니다21. 암, 자가면역 및 전염병을 포함한 다양한 인간 질환의 치료에 사용되는 가장 눈에 띄고 확장되는 약물 종류 중 하나인 항체 기반 치료제는 안전성과 효능에 영향을 미치는 이종 당형으로 생산됩니다21. EndoS와 EndoS2는 손상되지 않은 IgG 항체에 대한 두 효소의 엄격한 특이성과 화학효소적 접근법을 사용하여 균질한 N-글리칸을 IgG 항체로 전달할 수 있는 각각의 글리코신타제 돌연변이의 발견으로 인해 Fc 글리칸 리모델링에 특히 유용합니다23,24( 그림 1b). 정의된 당형을 갖는 항체의 생성은 항체 기능에 대한 각 당형의 역할을 이해하는 것뿐만 아니라 정의된 치료, 진단 및 약동학적 특성을 가진 항체 생산을 위해서도 중요합니다25.

1.5 was reached. Ampicillin (100 µg/mL) was used as selecting agent through the expression. Unless otherwise stated, bacteria were grown at 37 °C under shaking (220 rpm). Cells for inoculation of 10 mL M9+/D2O minimal medium with a starting OD600 of 0.1 were harvested by centrifugation, and excess of TB medium was removed. In all M9+/D2O minimal media, 3 g L−1 of 15N-ammonium chloride (Deutero) and 3 g L−1 of deuterated 12C-glucose (1,2,3,4,5,6,6-d7, Deutero) were used as the principal nitrogen and carbon sources, respectively. The next morning 2 mL of the starter culture were spin-down, supernatant was removed, and cells were transferred into 20 mL of freshly prepared M9+/D2O minimal medium. When an OD600 of 0.4 was reached, the culture volume was increased to 90 ml and cells were grown until an OD600 of 0.6–0.8 was reached. At this point, the temperature of the incubator was reduced to 16 °C and 10 mL of M9+/D2O minimal medium containing the desired labeled precursors and amino acids were added86. Amounts of isotopically labeled precursors for selective methyl labeling are given in Supplementary Table 4. Protein expression was induced with the addition of 1 mM or 0.5 mM isopropyl β-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG) for EndoS2 or EndoBT constructs, respectively. Cells were harvested when the maximal cell density was reached and stored at -20 °C. Labeled protein was purified28,42 and stored at 4 °C./p>

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